中国医科大学が2012年6月20日に発表した論文です。

出典　https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28788092

表題：
Diallyl trisulfide induces apoptosis in human primary colorectal cancer cells

[Google翻訳による日本語訳] ジアリルトリスルフィドはヒト原発性結腸直腸癌細胞においてアポトーシスを誘導する

要旨:
Colorectal cancer (CRC) is one of the most prevalent types of cancer worldwide and a common cause of morbidity and mortality in humans. The garlic-derived organosulfur compound diallyl trisulfide (DATS) has been shown to induce apoptosis in many human cancer cell lines in vitro and also affords significant protection against cancer in animal tumor models in vivo. There is no available information to show DATS-induced apoptosis in vitro and the molecular mechanisms of apoptosis in human primary colorectal cancer cells. In this study, we investigated the cytotoxic effects in DATS in primary colorectal cancer cells. DATS inhibited the viability of primary colorectal cancer cells in a time- and dose-dependent manner. After treatment with DATS, primary colorectal cancer cells exhibited DNA condensation by DAPI stain. DATS increased reactive oxygen species (ROS) production in primary colorectal cancer cells. The mitochondria-dependent apoptotic signaling pathway was shown to be involved as determined by increase in the levels of cytochrome c, Apaf-1, AIF and caspase-3 and caspase-9 in DATS-treated primary colorectal cancer cells. The decrease in the level of ΔΨm was associated with an increase in the Bax/Bcl-2 ratio which led to activation of caspase-9 and -3. Based on our results, DATS induces apoptotic cell death in human primary colorectal cancer cells through a mitochondria-dependent signaling pathway.

[Google翻訳による日本語訳]
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、世界中で最も一般的な種類の癌の１つであり、そしてヒトにおける罹患率および死亡率の一般的な原因である。ニンニク由来有機硫黄化合物ジアリルトリスルフィド（ＤＡＴＳ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで多くのヒト癌細胞株においてアポトーシスを誘導することが示されており、またｉｎ ｖｉｖｏで動物腫瘍モデルにおいて癌に対する有意な防御をもたらす。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＡＴＳ誘発アポトーシスおよびヒト原発性結腸直腸癌細胞におけるアポトーシスの分子メカニズムを示すために利用可能な情報はない。本研究では、原発性大腸癌細胞におけるDATSの細胞毒性効果を調べた。DATSは原発性結腸直腸癌細胞の生存率を時間および用量依存的に阻害した。DATSによる治療後、原発性結腸直腸癌細胞はDAPI染色によるDNA凝縮を示した。ＤＡＴＳは、原発性結腸直腸癌細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）産生を増加させた。ミトコンドリア依存性アポトーシスシグナル伝達経路は、DATS処理した原発性結腸直腸癌細胞におけるシトクロムc、Apaf-1、AIFおよびカスパーゼ-3およびカスパーゼ-9のレベルの増加によって決定されるように関与していることが示された。ΔΨｍレベルの減少は、カスパーゼ－９および－３の活性化をもたらすＢａｘ ／ Ｂｃｌ － ２比の増加と関連していた。我々の結果に基づいて、DATSはミトコンドリア依存性シグナル伝達経路を介してヒト原発性大腸癌細胞におけるアポトーシス細胞死を誘導する。DATS処理した原発性結腸直腸癌細胞におけるAIFならびにカスパーゼ3およびカスパーゼ9。ΔΨｍのレベルの減少は、カスパーゼ－９および－３の活性化をもたらすＢａｘ ／ Ｂｃｌ － ２比の増加と関連していた。我々の結果に基づいて、DATSはミトコンドリア依存性シグナル伝達経路を介してヒト原発性大腸癌細胞におけるアポトーシス細胞死を誘導する。DATS処理した原発性結腸直腸癌細胞におけるAIFならびにカスパーゼ3およびカスパーゼ9。ΔΨｍレベルの減少は、カスパーゼ－９および－３の活性化をもたらすＢａｘ ／ Ｂｃｌ － ２比の増加と関連していた。我々の結果に基づいて、DATSはミトコンドリア依存性シグナル伝達経路を介してヒト原発性大腸癌細胞におけるアポトーシス細胞死を誘導する。

《　中略　》

結果

DATS decreases the percentage of viability in human primary colorectal cancer cells
To measure DATS-mediated effects on human primary colorectal cancer cells, the cells after incubated with 10, 20 and 40 μM DATS for 24 h were harvested and the percentage of viable cells were measured by MTT assay. Results are shown in Fig. 1, indicating that increase of DATS concentration led to decreased percentage of viable cells. As expected, 24-h incubation showed apparent stronger dose-dependent effects of DATS.

DATS decreases the percentage of viability in human primary colorectal cancer cells. Cells at a density of 2×105 cells/well in 12-well plate were treated with 0, 10, 20 and 40 μM of DATS for 24 h then harvested for the determinations of percentage of viable cells from 3 patients (A, B and C) as described in Materials and methods. Data are presented as mean ± SD in triplicate. *P<0.05, significantly different compared between DATS and DMSO-treated groups.

DATS induces apoptosis of human primary colorectal cancer cells
To investigate the effect of DATS on nuclear alterations, cells were stained with DAPI and results are shown in Fig. 2, demonstrating that the cells underwent remarkable nuclear changes upon treatment. In the control (untreated) cells, the nuclei were intact, round, and uniformly stained. However, after exposure to DATS, the cells manifested nuclear shrinkage/condensation and nuclear fragmentation. At 20 μM of DATS, a number of cells exhibited nuclear shrinkage and chromatin condensation but these aberrant nuclear alterations were not seen in the control cells. These observations showed that DATS-induced apoptosis occurred in primary colorectal cancer cells.

DATS induces apoptosis human primary colorectal cancer cells. Cells at the density of 2×105 cells/well in 12-well plates were maintained 24 h then were incubated with 0 and 20 μM of DATS for 24 h, then isolated for the examination of apoptosis using DAPI staining and photographed under fluorescence microscopy.

DATS induces reactive oxygen species (ROS) production and decreases the level of mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in human primary colorectal cancer cells
To investigate whether or not DATS-induced apoptosis is via the production of ROS, we measured the intracellular level of ROS during treatment with DATS by DCFH-DA and using a flow cytometer and results are shown in Fig. 3A. Results indicate that DATS induced ROS production in a time-dependent manner. The oxidation of DCF was dependent upon DATS treatment time (Fig. 3A). To investigate whether or not DATS-induced apoptosis is through decreasing the levels of mitochondrial membrane potential, cells were collected and stained with DiOC6 and results are shown in Fig. 3B, indicating that DATS decreased the levels of ΔΨm in human primary colorectal cancer cells and these effects are time-dependent.

DATS induces reactive oxygen species (ROS) production and decreases the level of mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in human primary colorectal cancer. Cells incubated in 12-well plates for 24 h were treated with or without 20 μM of DATS for 0, 6 and 12 h. The cells were harvested and washed with PBS twice, re-suspended in 500 μl of 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) (10 μM) for ROS (A) and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6) (1 μmol/l) for ΔΨm (B). Cells then were incubated at 37°C for 30 min and were analyzed by flow cytometry as detailed in Materials and methods.

DATS affects caspase-9 and -3 activities in human primary colorectal cancer cells
To investigate whether or not DATS-induced apoptosis is via the activation of caspases, the cells after treatment with DATS were harvested and caspase-9 and -3 activities were measured and results are shown in Fig. 4. Results indicated that DATS promoted the activation of caspase-9 and caspase-3 in the examined cancer cells. Based on this observation, DATS induced apoptosis was via activation of caspase-9 and caspase-3.

DATS affect caspase-9 and caspase-3 activities in human primary colorectal cancer cells. Cells (2×105 cells/well) cultured in 12-well plates were treated with or without 20 μM DATS for 0 and 24 h, then cells were harvested and analyzed for caspase-9 (A) and -3 (B) activities by flow cytometric analysis as described in Materials and methods. Columns, mean (n=3); bars, SD. P<0.05 significantly different compared with control.

DATS affects apoptosis-associated proteins in human primary colorectal cancer cells
For further examining the effects of DATS-induced apoptosis in the human primary colorectal cancer cells through apoptosis-associated protein levels, the cells after exposure to 20 μM DATS for 24 h were harvested for western blotting and result are shown in Fig. 5. DATS increased the protein levels of cytochrome c, caspase-9 and caspase-3, showing that DATS promoted the release of cytochrome c from mitochondria, and then led to the activation of caspase-9 and caspase-3. Furthermore, DATS promoted the pro-apoptotic protein Bax and inhibited the anti-apoptotic protein, leading to apoptosis in the three examined human colorectal cancer cell types.

[Google翻訳による日本語訳]

DATSはヒト原発性大腸癌細胞における生存率を減少させる
ヒト原発性結腸直腸癌細胞に対するＤＡＴＳ媒介効果を測定するために、１０、２０および４０μＭ ＤＡＴＳと共に２４時間インキュベートした後の細胞を回収し、そして生存細胞の割合をＭＴＴアッセイによって測定した。結果を図１に示し、ＤＡＴＳ濃度の増加が生存細胞の割合の減少をもたらしたことを示している。予想通り、24時間のインキュベーションはDATSの明らかにより強い用量依存的効果を示した。

DATSはヒト原発性大腸癌細胞のアポトーシスを誘導する
核の変化に対するＤＡＴＳの効果を調べるために、細胞をＤＡＰＩで染色し、結果を 図２に示し、これは細胞が処理時に著しい核の変化を受けたことを実証している。対照（未処理）細胞では、核は無傷で丸く、そして均一に染色されていた。しかし、DATSにさらされた後、細胞は核の収縮/凝縮および核の断片化を示した。２０μＭのＤＡＴＳでは、多数の細胞が核収縮およびクロマチン凝縮を示したが、これらの異常な核の変化は対照細胞では見られなかった。これらの観察は、ＤＡＴＳ誘導性アポトーシスが原発性結腸直腸癌細胞において起こることを示した。

ヒト原発性結腸直腸癌細胞においてDATSは活性酸素種（ROS）産生を誘導しミトコンドリア膜電位（ΔΨm）のレベルを低下させる
DATS誘導アポトーシスであるか否かを調べるために介して ROSの生産、我々は、DCFH-DAによってDATSによる治療中にROSの細胞内レベルを測定し、フローサイトメーターを使用し、その結果を示す図3A。結果は、DATSが時間依存的にROS産生を誘導したことを示している。ＤＣＦの酸化はＤＡＴＳ処理時間に依存していた（図３Ａ）。DATS誘導アポトーシスは、ミトコンドリア膜電位のレベルを減少によるものであるか否かを調べるために、細胞を回収し、DIOCで染色した6との結果がで示されている図3B DATSは、ΔΨのレベル減少したことを示し、mは ヒト原発性結腸直腸癌細胞において、そしてこれらの効果は時間依存的である。

DATSはヒト原発性結腸直腸癌細胞におけるカスパーゼ9と3の活性に影響を与える
DATS誘導アポトーシスであるか否かを調べるために介してカスパーゼの活性化、DATSで処理した後、細胞を回収し、カスパーゼ-9および-3活性を測定し、結果をに示す図。4。結果は、ＤＡＴＳが調べた癌細胞においてカスパーゼ９およびカスパーゼ３の活性化を促進することを示した。この観察に基づいて、ＤＡＴＳ誘導アポトーシスはカスパーゼ９およびカスパーゼ３の活性化を介した。

DATSはヒト原発性結腸直腸癌細胞におけるアポトーシス関連タンパク質に影響を及ぼす
アポトーシス関連タンパク質レベルを介したヒト原発性結腸直腸癌細胞におけるＤＡＴＳ誘導アポトーシスの効果をさらに調べるために、２０μＭ ＤＡＴＳに２４時間曝露した後の細胞をウエスタンブロッティングのために回収した。結果を図５に示す。DATSは、シトクロムc、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-3のタンパク質レベルを増加させ、DATSがミトコンドリアからのシトクロムcの放出を促進し、次いでカスパーゼ-9およびカスパーゼ-3の活性化をもたらしたことを示している。さらに、DATSはアポトーシス促進タンパク質Baxを促進し、抗アポトーシスタンパク質を阻害し、3つの検査されたヒト結腸直腸癌細胞型においてアポトーシスをもたらした。